Применение иммуноферментного анализа для оценки гуморального и клеточного иммунного ответа при туберкулезе

Васильева Е.В.1, Вербов В.Н.1, Беклемишев А.Б.2, Перемолотова И.А.3, Тотолян А.А.1
  • 1ФГУН научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Роспотребнадзора, Санкт-Петербург.
  • 2НИИ биохимии СО РАМН, Новосибирск.
  • 3ФГУП "Гос.НИИ ОЧБ" ФМБА России, Санкт-Петербург, E-mail: alenalenkina@gmail.com.

Основная цель иммунологических исследований при туберкулезе - оценка состояния и выявление возможных изменений в иммунной системе, которые могут быть использованы для дифференциальной диагностики. Учитывая многокомпонентность и сложность структуры иммунного ответа, для его оценки необходимо использовать комплекс тестов, отражающих интенсивность как клеточного, так и гуморального иммунитета [1].

Цель работы заключалась в сравнении туберкулезных антигенов, используемых в непрямом варианте ИФА при обнаружении IgG - антител к возбудителю туберкулеза, для оценки гуморального иммунитета. Были изучены два антигена: первый антиген - PPDN-3, который представляет собой ультрафильтрат культур возбудителя туберкулеза штаммов DТSТ и Valee и используется в тест-системе "ИФА-анти-ТУБ", выпускаемой НИИЭМ имени Пастера (г.Санкт-Петербург); второй антиген - специфический рекомбинантный антиген P38 M. tuberculosis, полученный одним из авторов методом генетической инженерии в НИИ биохимии СО РАМН (г.Новосибирск). Сорбцию антигенов в лунках полистирольных планшетов проводили при следующих концентрациях: 2,5 мкг/мл для P38 и 40 мкг/мл для PPDN-3. Методика постановки ИФА - согласно инструкции по применению "ИФА-анти-ТУБ". Для каждого антигена было исследовано в диагностическом разведении 97 сывороток крови, полученных от больных с активным туберкулезным процессом, и 45 сывороток крови от здоровых доноров.

При этом у 12,5 % больных был ответ только на антиген Р38 и у 17,5 % - только на антиген PPDN-3, 52,5 % больных имели антитела к обоим белкам. Из полученных данных следует, что совместное использование микобактериальных антигенов P38 и PPDN- 3 в серодиагностике туберкулеза позволит достигнуть чувствительности 82,5% и специфичности 93,2% (табл. 1). Отсутствие антител у 17,5% больных туберкулезом позволяет предположить, что у них гуморальное звено иммунного ответа не является преимущественным.

Таблица 1. Результаты исследования сывороток больных туберкулезом и здоровых доноров в непрямом варианте ИФА с использованием иммуносорбентов на основе туберкулезных антигенов Р38 и PPDN-3.

В качестве маркера для оценки напряженности клеточного иммунного ответа используют гамма-интерферон [2]. Количественное измерение гамма-интерферона (ИФН-гамма) позволяет диагностировать не только острые формы туберкулезной инфекции, протекающие преимущественно с клеточным типом иммунного ответа, но и латентную туберкулезную инфекцию (ЛТБИ). В качестве индуктора гамма-интерферона используют микобактериальный белок ESAT-6, секретируемый микобактериями на ранней стадии роста. Этот белок содержит эпитопы, распознаваемые протективными Т-клетками [3].

Иммунодоминантный белок ESAT-6 был разбит на отдельные, 15-ти членные фрагменты с перекрыванием в 9 аминокислотных остатков с помощью программы PeptGen. Для выделенных фрагментов были синтезированы 15 пептидов длиной 13-15 аминокислотных остатков. Синтез пептидов проводили на многоканальном синтезаторе пептидов Apex 396 на TentaGel полимерах (Rapp Polymere, GmbH) с использованием Fmoc-технологии твердофазного синтеза. В качестве временной защитной группы использовали флюоренилметилоксикарбонильную группу, для защиты боковых цепей трифункциональных аминокислот применялись защиты третбутильного и тритильного типов. После сборки полипептидной цепи полученные пептиды отщепляли от полимера с одновременным удалением постоянных защитных групп под действием трифторуксусной кислоты в присутствии скавенджеров. Чистоту полученных соединений определяли с помощью аналитической обращено-фазовой хроматографии. Масс-спектральный анализ выявил наличие пика молекулярного иона с расчетной молекулярной массой в каждом продукте синтеза.

Для предварительной оценки диагностической значимости полученных пептидов было обследовано 7 больных в возрасте 27-55 лет, проходивших лечение в СПб НИИ Фтизиопульмонологии. Из них с установленными диагнозами: фиброзно-кавернозный туберкулез легких, МБТ(+) - 6 пациентов; туберкулема S6 правого легкого, МБТ(-) - 1 пациент. Обследовано также 3 здоровых донора.

Образцы цельной венозной гепаринизированной крови были разлиты по 1 мл в 3 разные маркированные пробирки: контрольная проба без антигена и 2 опытные пробы, в одну из которых вносили 10 мкл фитогемаглютинина (ФГА) с концентрацией 25 мкг/мл, а в другую - 10 мкл исследуемых пептидов с концентрацией 10 мкг/мл. Лунки с ФГА использовали в качестве положительного контроля. Образцы крови инкубировали при 37 °С в течение 20-24 ч на ротаторе. Затем отбирали по 200 мкл образцов полученной плазмы, в которых определяли концентрацию ИФН-гамма методом твердофазного ИФА. Для оценки продукции ИФН-гамма использовали следующий коэффицент:

ИС = Кинд/Кспн, где ИС - индекс стимуляции, Кинд - значение индуцированной продукции цитокина (пг/мл), Кспн - значение спонтанной продукции цитокина (пг/мл).

Были получены следующие результаты. У больных туберкулезом наблюдается резкое увеличение спонтанной продукции ИФН-гамма (343,5 пг/мл - среднее значение, 289-398 пг/мл - разброс) по сравнению с группой здоровых (111,5 (58-165)). При оценке ИС индуцированной продукции ИФН-гамма у больных туберкулезом наблюдается угнетение продукции ИФН-гамма (1,162 (0,78-1,544)) в присутствии ФГА по сравнению с группой здоровых доноров (3,69 (1,38-6,00)). В случае стимуляции пептидами наблюдается обратная закономерность: у больных туберкулезом имеет место увеличение продукции ИФН-гамма (2,31 (0,58-4,04)) по сравнению с группой здоровых доноров (0,93 (0,68-1,18).

Таким образом, комплексное определение наличия антител в диагностическом разведении и количественное определение гамма-интерферона до и после стимуляции иммунокомпетентных клеток крови специфическими митогенами позволит с большей уверенностью ставить диагноз заболевания и, возможно, прогнозировать его тяжесть и излечиваемость.

Литература
  1. Чернушенко Е. Ф., Кадан Л. П., Панасюкова О. Р., Петишкина В.Н. Цитокиновая регуляция и развитие вторичных иммунодефицитных состояний при туберкулезе легких (научный доклад на заседании Ученого совета ДУ "Национальный институт фтизиатрии и пульмонологии имени Ф.Г. Яновского АМН Украины" 16.06.2009 года).
  2. Г.-Р. Бурместер, А. Пецутто Наглядная иммунология // Пер.с англ. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2007. - С. 230-231.
  3. Doherty TM, Demessie A, Olobo J, et al // Immune responses to the Mycobacterium tuberculosis-specific antigen ESAT-6 signal subclinical infection among contacts of tuberculosis patients.J Clin Microbiol 2002. - P. 704-06.

Все публикации

ФБУН НИИ эпидемиологии
и микробиологии имени Пастера
Отдел новых технологий