Разработка и применение тест-системы для определения чувствительности Trichomonas vaginalis к противопротозойным препаратам групп 5-нитроимидазола и 5-нитрофурана

Махлай Н.С., Березина Л.А., Вербов В.Н., Закревская А.В., Жебрун А.Б.
  • ФГУН НИИЭМ имени Пастера Роспотребнадзора, Санкт-Петербург.

Цель. Разработка тест-системы для определения чувствительности Trichomonas vaginalis к препаратам групп 5-нитроимидазола и 5-нитрофурана.

Материалы и методы. Определение минимальных цидных концентраций (МЦК) противопротозойных препаратов проводили при культивировании лабораторных штаммов Т.vaginalis в лунках планшетов с питательной средой, содержащей различные концентрации этих препаратов. Оценку жизнеспособности возбудителя определяли с помощью витальной окраски трипановым синим и по способности к последующему росту на питательной среде без добавления противопротозойных препаратов. Конструирование тест-системы проводили путем подбора условий для фиксации препаратов в лунках планшетов и контроля сохранения активности после фиксации. Для апробации тест-системы использовали 109 изолятов, выделенных от больных с подтвержденным диагнозом трихомониаз.

Результаты. При культивировании десяти лабораторных штаммов было показано, что МЦК исследуемых препаратов имели следующие значение мкг/мл: метронидазол 5, тинидазол 1,25 мкг/мл, секнидазол 2,5 мкг/мл, ниморазол 1,25 мкг/мл, орнидазол 2,5 мкг/мл, клотримазол 15 мкг/мл, нифуратель 1,25 мкг/мл. При исследовании клинического материала была выявлена однотипная чувствительность штаммов, выделенных при остром трихомониазе, и различная - при хроническом, при этом один штамм обладал множественной устойчивостью.

Заключение. Разработана простая и доступная для рутинной лабораторной работы тест-система для определения чувствительности T.vaginalis к препаратам групп 5-нитроимидазола и 5-нитрофурана. Эффективность теста обеспечивает высокую чувствительность, воспроизводимость и меньшую длительность процедуры по сравнению с классическим методом, что позволяет с наибольшей вероятностью подобрать препарат для терапии. Изучено применение этой тест-системы для определения чувствительности изолятов, выделенных при остром и при хроническом трихомониазе.

Ключевые слова: Trichomonas vaginalis, тест, 5-нитроимидазолы, 5-нитрофураны, чувствительность.

Development and application of a test for sensitivity evaluation of trichomonas vaginalis to nitroimidazoles and nitrofurans

N.S. Makhlay, L.A. Berezina, V.N. Verbov, A.V. Zakrevskaya, A.B. Zhebrun.
  • Pasteur Institute of Epidemiology and Microbiology, St.Petersburg, Russia.

Aim. To develop a test for determining the Trichomonas vaginalis sensitivity to 5-nitroimidazole and 5-nitrofuran derivatives.

Materials and methods. Determination of minimal lethal concentrations (MLC) of anti-protozoa drugs was carried out by culturing T.vaginalis strains in wells with medium containing various concentrations of these drugs. The viability evaluation of the pathogen was determined by vital staining with trypan blue and by the ability to subsequent growth in medium without adding drugs. Designing the test was performed by adjusting conditions for drugs fixation in plates wells and control the activity preservation after it. 109 isolates from patients who had been confirmed of having trichomoniasis were used for approbation of the test.

Results. During the cultivation of ten strains T.vaginalis it was shown that MLC of studied drugs were as follows µg/ml: metronidazole 5 µg/ml, tinidazole 1,25 µg/ml, seknidazol 2,5 µg/ml, nimorazol 1,25 µg/ml, ornidazole 2,5 µg/ml, clotrimazole 15 µg/ml and nifuratel 1,25 µg/ml. In the study with clinical samples it was shown similar sensitivity of strains isolated from patients with acute infection and variable sensitivity of strains isolated from patients with chronicle infection. One strain possessed a multiple resistance.

Conclusion. A simple and practical test for routine laboratory work was designed for screening T.vaginalis sensitivity to 5-nitroimidazole and 5-nitrofuran derivatives. The performance of the test provides high sensitivity and reproducibility, less time consuming compared with classic method, making it more suitable for selection therapy. The application of this test for determining the sensitivity of isolates in acute and chronic trichomoniasis was studied.

Key words: Trichomonas vaginalis, test, 5-nitroimidazole, 5-nitrofuran, sensitivity.

Введение

Традиционная специфическая терапия трихомониаза заключается в применении препаратов группы 5-нитроимидазола (5-НИМЗ), обладающих высокой активностью в отношении Protozoa. Все эти препараты имеют нитрогруппу в положении 5-го имидазольного цикла и практически не различаются между собой по степени и спектру антипротозойной активности [1]. Механизм действия этих препаратов основан на их проникновении в клетку путем диффузии, восстановлении нитрогруппы в гидрогеносомах с участием пируват-ферредоксин оксидоредуктазы и образовании свободных нитрит радикалов, которые повреждают цепи ДНК, вызывая гибель простейшего в течение 8 часов. Хотя однотипный механизм действия обуславливает возможность развития перекрестной резистентности трихомонад к 5-НИMЗ, она, тем не менее, является неполной и выявляется относительно редко [6].

Первый представитель этого ряда - метронидазол был синтезирован в 50-х годах прошлого века и уже в 60-х его стали использовать для лечения трихомонадной инфекции [2]. Также широкое применение в медицинской практике получили тинидазол и орнидазол. В значительной степени интерес к этим препаратам связан с их достаточно хорошей переносимостью и хорошими фармакокинетическими свойствами. Например, тинидазол имеет более длительный период полувыведения, чем метронидазол и его концентрация в вагинальных выделениях близка к концентрации в сыворотке, что говорит о лучшей биодоступности тинидазола в этой области. Перекрестная устойчивость тинидазола с метронидазолом является неполной, при этом его минимальная цидная концентрация (МЦК) ниже чем у метронидазола [4].

Орнидазол и секнидазол также имеют по сравнению с метронидазолом более длительный период полувыведения. Ниморазол, напротив, элиминируется быстрее. Тем не менее препарат обладает выраженной антипротозойной активностью, поскольку два его основных метаболита более активны, чем метаболиты метронидазола [3].

Все эти препарата зарегистрированы и разрешены для медицинского применения в России.

Неэффективность терапии урогенитального трихомониаза может быть обусловлена целым рядом факторов, связанных с особенностями как макро, так и микроорганизмов. К числу наиболее частых причин неэффективности лечения большинство авторов относят недостаточно высокую комплаентность пациентов и реинфекцию, хотя в отдельных статьях ведущее место отводится резистентности Т.vaginalis к метронидазолу. Среди других возможных причин неудачного лечения указывают недостаточную абсорбцию препарата в желудочно-кишечном тракте, низкую степень его доставки в урогенитальные органы, инактивацию микрофлорой влагалища, а также низкую концентрацию цинка в плазме крови [1].

Первые случаи резистентности Т.vaginalis к метронидазолу были зарегистрированы в 1962 г [6]. По нашим данным, полученным при тестировании 865 клинических штаммов Т. vaginalis, выделенных в 2006-2009 гг., резистентность к метронидазолу была выявлена у 8,1 % изолятов.

В последние годы актуальна также другая группа этиотропных средств - препараты 5-нитрофурана (5-НИТФ), в частности нифуратель. Нитрофураны в качестве монотерапии обычно используют в тех случаях, когда лечение 5-нитроимидазолами невозможно, например, в случаях имеющейся гиперчувствительности.

В настоящее время назначение лечения производят в соответствии с протоколом ведения больных урогенитальным трихомониазом (утв. МИНЗДРАВСОЦРАЗВИТИЯ РФ 14.01.2005). Этот документ не регламентирует проведение предварительного подбора препарата in vitro для каждого штамма. Вероятно, следствием такого подхода является высокая частота случаев неэффективного лечения и хронизации заболевания.

Несмотря на существование проблемы, связанной с подбором наиболее подходящего для каждого пациента препарата, в настоящее время не существует доступной для широкой практики тест-системы, позволяющей определять чувствительность Т.vaginalis к антипротозойным препаратам in vitro.

Для определения чувствительности Т.vaginalis к различным лекарственным средствам используют метод серийных разведений. Суть метода заключается в приготовлении серийных разведений лекарственного средства в жидкой питательной среде (контроль - среда без лекарственного средства). Затем в каждую пробирку со средой вносят одинаковую концентрацию культуры исследуемого штамма Т.vaginalis и после инкубации в течение 48-72 часов микроскопически определяют наличие живых форм возбудителя в каждой пробирке. Этот метод трудоемок и имеет высокую стоимость.

В данной работе представлены результаты разработки и применения тест-системы для определения чувствительности Т.vaginalis к противопротозойным препаратам.

Материалы и методы

Штаммы Т.vaginalis Pr001, Pr002, Pr004, Pr005, Pr006, Pr007, Pr011, Pr027 были получены из Городского кожно-венерологического диспансера (г. Санкт-Петербург). Перед проведением исследования культуры выращивали на питательной среде для выявления трихомонад - СВТ (№ ФСР 2009/05982) и использовали при достижении логарифмической фазы роста. Микроскопию нативных препаратов проводили при помощи устройства для микробиологических исследований - гребенка (номер заявки 2010124024 от 11.06.2010 г.). Подсчет клеток проводили в камере Горяева.

Было исследовано 109 штаммов Т.vaginalis, выделенных от больных с установленным диагнозом трихомониаз. Диагноз был установлен на основе культурального исследования на питательной среде СВТ, а также ПЦР-РТ с использованием набора фирмы ИнтерЛабСервис (№ ФС 01262006/5190-06) на приборе АНК-32. При этом 10 штаммов (группа А), было выделено от больных с острой формой инфекции и 99 штаммов (группа Б) - от пациентов с хронической формой урогенитального трихомониаза.

Использовали субстанции следующих противопротозойных препаратов: метронидазол, тинидазол, орнидазол, клотримазол производства Sigma-Aldrich (USA) и секнидазол, ниморазол, нифуратель производства Zxchem (China). Для приготовления исходных растворов препаратов с концентрацией 1 мг/мл в качестве растворителя использовали демитилсульфоксид (ДМСО). Рабочие растворы готовили последовательным разведением исходных растворов в питательной среде СВТ.

Результаты

Разработка тест-системы для определения чувствительности T.vaginalis. С целью создания тест-системы был решен ряд практических задач: при использовании лабораторных штаммов было определено оптимальное время культивирования в лунках планшетов и выбрана посевная доза заражающего материала, что позволило стандартизировать при последующих опытах основные условия проведения анализа. Было установлено, что максимальный прирост биомассы происходит через 48 часов культивирования при посевной дозе заражающего материала 5 х 104 кл/мл (рис. 1).

Рис. 1. Кривые роста лабораторных штаммов T.vaginalis в зависимости от количества заражающего материала.

Для определения МЦК противопротозойных препаратов проводили культивирование штаммов Т.vaginalis в питательной среде, содержащей различные концентрации этих препаратов. При определении МЦК, под которой понимали наименьшую концентрацию препарата, вызывающую гибель 100% клеток трихомонад, использовали два критерия: оценку жизнеспособности возбудителя по методу витальной окраски трипановым синим и способность штаммов к последующему росту в питательной среде СВТ без добавления противопротозойных препаратов. Одновременно проводили определение МЦК традиционным методом последовательных разведений препаратов в пробирке [5] и были получены идентичные результаты.

Определение МЦК описанных выше препаратов позволило выбрать их рабочие концентрации. МЦК для исследованных препаратов имеют следующие значения: КТЗ - 15 мкг/мл, МТЗ - 5 мкг/мл, СКЗ - 2,5 мкг/мл, ОРЗ - 2,5 мкг/мл, НМЗ - 1,25 мкг/мл, ТНЗ - 1,25 мкг/мл и НФТ - 1,25 мкг/мл.

Для исследования сохранения активности препаратов в выбранных МЦК проводили их фиксацию в лунках полистироловых планшетов в течение 24 часов при температуре 50 °С в вакуумном сушильном шкафу. Сохранение активность высушенных препаратов оценивали при сравнении их способности оказывать цидное действие на штаммы Т.vaginalis до и после фиксации.

На следующем этапе было проведено определение срока хранения стрипов с фиксированными противопротозойными препаратами методом "ускоренного старения". При этом было показано, что срок хранения таких стрипов без потери активности зафиксированных в лунках препаратов составляет 13 месяцев.

Таким образом, в состав разработанной тест-системы для определения чувствительности T.vaginalis к противопротозойным препаратам входят следующие компоненты:

  • питательная среда для выявления T.vaginalis;
  • стрипы с сорбированными противопротозойными препаратами;
  • пленки для заклеивания стрипов;
  • гребенки для микроскопии.

Рис. 2. Схема расположения противопротозойных препаратов и контроля в лунках стрипа и помещения гребенки в лунки стрипа: а - устройство для микроскопии, б - стрип с фиксированными препаратами (К - контроль, НФТ - нифуратель, КТЗ - клотримазол, СКЗ - секнидазол, ОРЗ - орнидазол, НМЗ - ниморазол, ТНЗ - тинидазол. МТЗ - метронидазол).

Апробация тест-системы. Проводили в лаборатории иммунология ФГУН НИИЭМ имени Пастера, где для проведения исследования чувствительности к противопротозойным препаратам первоначально осуществляли накопление выделенных изолятов на питательной среде СВТ до концентрации 105 кл/мл. После этого готовили инокулят путем суспензирования осадка в 0,5 мл свежей питательной среды СВТ. Для проведения исследования из набора брали стрипы с фиксированными противопроозойными препаратами и устанавливали их в рамку-держатель. Во все лунки (рис. 2б) вносили прогретую до 37 °С питательную среду СВТ и приготовленный инокулят, который перед внесением перемешивали пипетированием. Стрип заклеивали пленкой и помещали в термостат при температуре 37 °С.

Учет результатов проводили через 48 часов. Для этого содержимое лунок перемешивали при помощи многоканальной пипетки, а затем в лунки стрипа погружали зубцы гребенки (рис. 2а). Первоначально просматривали зубец-контроль на наличие клеток T.vaginalis, затем все остальные зубцы. При отсутствии живых форм T.vaginalis в лунке с препаратом штамм оценивали как чувствительный. При наличии живых форм T.vaginalis в лунке с препаратом штамм оценивали как резистентный.

Таблица 1 - Результаты апробации тест-системы на клинических штаммах T.vaginalis.

Обозначения: R - резистентный, S - устойчивый.

Полученные результаты представлены в таблице 1. Из всех изолятов группы А только один обладал резистентностью к клотримазолу и ниморазолу. Напротив, значительная часть штаммов группы Б была устойчива к метронидазолу и другим лекарственным средствам, при этом один изолят обладал резистентностью сразу к четырем препаратам.

Обсуждение

Разработана тест-система для определения чувствительности T.vaginalis к широкому спектру противопротозойных препаратов. Тест-система основана на простом и доступном для рутинной лабораторной работы методе. Эффективность метода обеспечивает 95 % чувствительности и 99 % воспроизводимости, что позволяет с наибольшей вероятностью подобрать препарат для терапии.

Разработанная тест-система принципиально отличается от существующего способа определения чувствительности тем, что отсутствуют стадии приготовления и разведения препаратов ex tempore, а стадия учета результатов упрощена и ускорена за счет использования витальной окраски и устройства для микроскопических исследований, разработанного нами. Все это позволяет стандартизовать процедуру проведения исследования на всех ее этапах.

Предлагается также использовать эту тест-систему для одновременного выявления T.vaginalis и определения чувствительности к препаратам, т.е. тест-система позволит еще на стадии выявления заболевания проводить подбор препарата лечения без повторного забора материала, поскольку входящая в состав набора среда СВТ позволяет накапливать и сохранять культуру T.vaginalis в течение недели.

Тестирование 109 штаммов показало, что штаммы, изолированные у пациентов с острой формой трихомонадной инфекции, как правило, чувствительны к действию метронидазола и других антипротозойных препаратов, в то время как культуры, выделенные от пациентов с хроническим трихомониазом, обладали резистентностью в 23,1 % (метронидазол) - 71,7 % (ниморазол) случаев. Такое различие свойств может объяснять довольно высокую распространенность трихомониаза среди населения нашей страны и свидетельствует о целесообразности определения чувствительности T.vaginalis к противопротозойным препаратам in vitro.

Работа поддержана грантом молодых ученых ФГУН НИИЭМ имени Пастера Роспотребнадзора.

Контактная информация: Махлай Наталья Сергеевна, 197101, Санкт-Петербург, ул. Мира, 14, ФГУН НИИЭМ им. Пастера Роспотребнадозора, р.т. (812) 232-80-35.

Литература

  1. Падейская Е.Н. Препараты группы 5-нитроимидазола для лечения анаэробных и протозойных инфекций. Обзор литературы. Инфекции и антимикробная терапия. 2000, 2(4): 110-116.
  2. Dunne R.L., Dunn L.A., Upcroft P. et al. Drug resistance in the sexually transmitted protozoan Trichomonas vaginalis. Cell Res. 2003, 13:239-249.
  3. Cudmore S.L., Delgaty K.L., Hayward-McClelland S.F. et al. Treatment of infections caused by metronidazole-resistant Trichomonas vaginalis Clin. Microbiol. Rev. 2004, 17(4):783-793.
  4. Nailor M.D., Sobel J.D. Tinidazole for the treatment of vaginal infections. Expert Opin. Investig. Drugs. 2007, 16(5):743-751.
  5. Butler S.E., Augostini P., Secor W.E. Mycoplasma hominis infection of Trichomonas vaginalis is not associated with metronidazole-resistant trichomoniasis in clinical isolates from the United States. Parasitol. Res. 2010, 107(4):1023-1027.
  6. Upcroft P., Upcroft J.A. Drug targets and mechanisms of resistance in the anaerobic protozoa. Clin. Microbiol. Rev. 2001, 14(1):150-164.

Все публикации

ФБУН НИИ эпидемиологии
и микробиологии имени Пастера
Отдел новых технологий