Разработка тест-системы для выявления Trichomonas vaginalis методом флуоресцирующих антител

Махлай Н.С., Вербов В.Н.
  • ФГУН НИИЭМ имени Пастера Роспотребнадзора, Санкт-Петербург, E-mail: Natalia.makhlay@gmail.com.

Одно из центральных мест в структуре заболеваемости инфекциями, передающимися половым путем, занимает трихомоноз. В последние годы заболеваемость трихомонозом в РФ составляет около 140 случаев на 100 тыс. населения [1]. Регламентируемыми методами обнаружения трихомонад являются микроскопический и культуральный, т.е. прямая идентификация возбудителя в мазке либо при культивировании на питательной среде [2]. Поэтому в диагностике трихомонадной инфекции снижение субъективизма микробиологических методов за счет использования специфического окрашивания представляет значительный практически интерес. Необходимо отметить, что в настоящее время не существует отечественных тест-систем для выявления Trichomonas vaginalis методом прямой иммунофлуоресценции (ПИФ).

Целью данной работы было разработать тест-систему для выявления T.vaginalis методом ПИФ.

Материалы и методы. Для получения гипериммунных кроличьих сывороток использовали два антигена: рекомбинантный - трихомонадный поверхностный белок АР65, а также трихомонадные антигены, полученные после лизирования смеси восьми штаммов T.vaginalis. Цикл иммунизации длился 90 дней. Введение иммуногенов осуществляли внутрикожно и внутримышечно, для усиления иммунного ответа при первой иммунизации использовали полный адьювант Фрейнда, который в дальнейшем заменили на неполный. Бустерные иммунизации проводили с интревалом в 21 день.

Выделение общеглобулиновой фракции проводили методом высаливания из цельной сыворотки сернокислым аммонием (рН=7,2). Разделение общеглобулиновых фракций проводили на ионообменнике ДЕАЕ-целлюлоза в градиенте хлористого натрия (рН=6,3). В полученных пиках определяли специфическую активность и белок. Конъюгацию иммуноглобулинов с ФИТЦ фирмы "Sigma" проводили по стандартному протоколу коньюгирования поликлональных антител [3]. Чувствительность полученных препаратов определяли в реакции ПИФ с применением различных контрастирующих веществ.

Результаты и обсуждения. Были получены высокотитражные специфические антисыворотки к двум трихомонадным белками: рекомбинантному и суммарному. Было показано нарастание иммунного ответа в течение 70 дней, после чего были получены пики активности, которые не увеличивались после реиммунизации (Рис. 1). При иммунизации суммарным антигеном максимальные титры сывороток в непрямом варианте ИФА составили 1:10240, а при иммунизации рекомбинантным белком AP65 титры сывороток были в 2 раза выше.

Рисунок 1 - Нарастание антител при иммунизации кроликов трихомонадными белками.

Рабочее разведение конъюгатов определяли в реакции ПИФ, для этого использовали семь лабораторных штаммов T.vaginalis. Специфическое свечение оценивали в крестах. Таким образом, при анализе препаратов было выявлено специфическое зеленое свечение всех штаммов не менее чем на три креста для двух коньюгатов. Коньюгат, полученный на основе антисыворотки к рекомбинантному белку AP65, был такой же чувствительный, как и коньюгат, полученный на основе нативного антигена, и их рабочее разведение составило 1:8. Использование 0,01 % раствора синьки Эванса увеличивает контрастность получаемого изображения и делает результаты микроскопии более однозначными. Однако при микроскопии удобнее работать с коньюгатом, который был получен на основе суммарного атигена, поскольку он дает свечение всей клетки с хорошо просматриваемыми жгутиками, тогда как при использовании конъюгата анти-АР65 свечение наблюдается на поверхности всей или части клетки в виде гранул.

В результате исследования были получены два коньюгата для выявления Trichomonas vaginalis методом ПИФ на основе анти-IgG Trichomonas vaginalis - ФИТЦ и анти-IgG AP65-ФИТЦ. В предварительных модельных испытаниях препаратов показана возможность их использования для диагностики трихомониаза при наличии в исходном материале минимум 103 клеток трихомонад на мл.

Литература
  1. Кубанова А.А. Анализ эпидемиологической ситуации и динамика заболеваемости инфекциями, передаваемыми половым путем, и дерматозами на территории Российской федерации / И.Н. Лесная, А.А. Кубанов, Л.Е. Мелехина, М.А. Каспирович // Вестник дерматологии и венерологии. - 2010. - № 5. - С. 4-21.
  2. Протокол ведения больных. Урогенитальный трихомониаз (Утв. Минздравсоцразвития РФ 14.01.2005).
  3. Roederer M., Conjugation of monoclonal antibodies (August, 2004). http://www.drmr.com/abcon/.

Все публикации

ФБУН НИИ эпидемиологии
и микробиологии имени Пастера
Отдел новых технологий