Применение технологии xMap для поиска информативных биомаркеров активности туберкулезного процесса

Васильева, Е.В.

Актуальность

По данным многочисленных исследований метод диагностики туберкулеза (ТБ), основанный на определении уровня продукции IFNγ клетками периферической крови в ответ на стимуляцию ранними антигенами микобактерий ESAT-6 и CFP-10, высоко специфичен при выявлении лиц, инфицированных Mycobacterium tuberculosis. Основным недостатком данного метода является то, что он не позволяет проводить дифференциальную диагностику активного ТБ и латентной туберкулезной инфекции (ЛТБИ).

Цель исследования – выбор информативных биомаркеров активности туберкулезного процесса.

Материалы и методы исследования

Было обследовано 54 больных впервые выявленным ТБ легких до начала специфической противотуберкулезной терапии, находившихся в стационаре СПбГБУЗ Городского противотуберкулезного диспансера и ЦНИИТ РАМН с сентября 2011 по май 2012 года. Обследованы также 43 здоровых донора и группа контактных по ТБ лиц (n=47), в которую были включены сотрудники стационаров противотуберкулезных учреждений со стажем работы более 1 года. У 65 % больных имел место инфильтративный ТБ легких, у 13 % – фиброзно-кавернозный ТБ. Оставшиеся 22 % составили больные с казеозной пневмонией (6 %), очаговым ТБ (6 %), диссеминированным ТБ (6 %) и туберкулемой (4 %). Всеми лицами, включенными в исследование (n=144), был выполнен КФТ. Тест проводили строго согласно инструкции производителя. Результаты оценивали с помощью программного обеспечения QFT 2.62. Помимо IFNγ мы определяли спонтанную (NIL) и антигениндуцированную (AG) продукцию 10 цитокинов (EGF, MIP-1β, VEGF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-1α, IFNα2, TGFα, TNFα), а также sIL-2Rα и sCD40L с помощью технологии xMap с использованием магнитных частиц "Milliplex Mag" и анализатора "MagPix". Также у 48 обследуемых определяли содержание IP-10 иммуноферментным методом с использованием набора реагентов "Bender Medsystems" (Вена, Австрия). При статистических расчетах анализировали значения спонтанной продукции исследуемых биомаркеров (NIL), антигениндуцированной продукции (AG) и разности между ними (AG-NIL). Для обработки полученных данных использовали пакеты программ MS Excel, Prizm 5.0 (GraphPad Software Inc.), JMP 9.0. Для оценки диагностической ценности и выбора порогового значения применяли анализ характеристической ROC кривой с вычислением площади под кривой операционной характеристики (ППК). С целью нахождения оптимальной комбинации биомаркеров был применен метод построения классификационных деревьев решений.

Результаты исследования

В настоящее время КФТ, основанный на определении IFNγAG-NIL, является почти единственным методом выявления ТБ инфицирования. Мы поставили задачу выявить дополнительные биомаркеры, которые также могут использоваться для ответа на этот вопрос. Для этого у 144 обследованных определяли продукцию 12 цитокинов (см. "Материалы и методы") и сравнивали полученные значения с результатами теста КФТ (в случае IP-10 исследования проводили только у 48 пациентов). Из 12 проанализированных показателей высокая корреляционная связь с IFNγAG-NIL была отмечена только для IL-2 (r=0,79; p<0,0001) и IP-10 (r=0,71; p<0,001). Проведенный анализ показал, что IP-10 и IL-2 могут рассматриваться в качестве полезных альтернативных биомаркеров для выявления ТБ инфицирования, так как оба обладают ППК выше 0,8, при этом применение IP-10 позволяет работать в существенно более широком диапазоне определяемых концентраций, что может позволить избежать получения сомнительных результатов и повысить надежность диагностики.

Следующая цель исследования заключалась в поиске биомаркеров, позволяющих проводить дифференциальную диагностику активного ТБ и ЛТБИ. Для этого мы проанализировали результаты определения 12 цитокинов у больных активным ТБ легких (диагноз подтвержден микробиологически) (n=27) и контактных лиц с ЛТБИ (n=26) с положительным результатом КФТ. Контактные лица с ЛТБИ и больные активным ТБ различались по концентрации в плазме крови следующих цитокинов: sIL2-RαNIL, sIL2-RαAG, sIL2-RαAG-NIL, IFN-γAG, IFN-γAG-NIL, IL-6NIL, IL-6AG, TGFαNIL, TGFαAG, IFN-α2AG, TNFαAG. Анализ характеристических кривых при фиксированном значении специфичности 81 % показал, что ни один из биомаркеров не обладал чувствительностью (> 70 %), что исключало возможность их изолированного использования с диагностической целью.

Построение дерева решений в программе JMP 9.0. позволило выбрать комбинацию маркеров, обеспечивающую дискриминацию между больными ТБ и контактными лицами с ЛТБИ. В результате были выбраны три наиболее значимых маркера: IFNγAG-NIL, TGFαNIL и IL-6AG (пороговые значения 256 пг/мл (6,4 МЕ/мл); 17,0 пг/мл и 2039 пг/мл, соответственно) и определены критерии включения лиц в исследуемые группы:

  1. Критерии отбора для больных активным ТБ:
    При одновременном определении содержания цитокинов IFNγAG-NIL, TGFαNIL и IL-6AG превышение порогового значения хотя бы одним из показателей.
  2. Критерии отбора для лиц с ЛТБИ:
    При одновременном определении содержания цитокинов IFNγAG-NIL, TGFαNIL и IL-6AG значения ниже пороговых по всем трем показателям.

Предложенные количественные критерии содержания цитокинов IFNγAG-NIL, TGFαNIL и IL-6AG в плазме крови выявляли 96,3 % (26 из 27) случаев активного туберкулеза и 80,7 % (21 из 26) случаев ЛТБИ (ППК=0,9). Мы проверили возможность использования данного алгоритма при сравнении больных ТБ и контактных лиц независимо от результатов КФТ и наличия бактериовыделения. Данный алгоритм позволил правильно идентифицировать 41 из 54 больных ТБ (чувствительность 76 %) и 35 из 47 контактных лиц (специфичность 75 %, ППК=0,8).

Выводы

На основании полученных данных перспективным, по нашему мнению, является использование двухступенчатого алгоритма диагностики ТБ, как предлагает и ряд других авторов. На первом этапе предлагается на выбор проводить количественное измерение IFNγ, IP-10 или IL-2, тем самым выявляя контингент лиц, инфицированных микобактериями. На втором этапе, для определения активности ТБ процесса, предлагается проводить количественное определение TGF-α и IL-6.

Все публикации

ФБУН НИИ эпидемиологии
и микробиологии имени Пастера
Отдел новых технологий