Усовершенствование выявления возбудителя коклюша с помощью мультиплексной ПЦР

Коклюш — острое респираторное заболевание, вызываемое бактериями вида Bordetella pertussis. Самыми характерными симптомами являются приступы кашля, но у детей, заболевших в первые полгода жизни, клиническая картина может быть нетипичной. В этой группе заболевание протекает тяжело и может стать смертельным. Несмотря на программу вакцинации, заболевание до сих пор не искоренено и выявляется, в том числе, в развитых странах. Дополнительной проблемой оказалось, что помимо B. pertussis возбудителями коклюша могут быть бордетеллы видов B. parapertussis, B. holmesii и B. bronchiseptica. Эти три вида могут вызывать коклюш с типичной и нетипичной симптоматикой, и, чаще всего, заболевание протекает легче. Вакцинация коклюшной вакциной не защищает от этих возбудителей.

Культуральный метод не является достаточно чувствительным для выявления бордетелл в клиническом материале. Более точный метод — выявление ДНК патогена методом ПЦР в мазке из ротоглотки. Проблемным моментом является выбор мишеней, с помощью которых можно выявить патогены нескольких видов и идентифицировать видовую принадлежность возбудителя. В качестве подобных мишеней были выбраны три инсерционных элемента IS481, IS1001, IS1002 и ген рекомбиназы recA. Для выявления генетических мишеней применяли ПЦР в реальном времени. Четыре мишени выявляли в двух реакционных смесях, по две мишени в каждой. Идентификация видов производилась следующим образом. В присутствии B. pertussis в реакционной смеси накапливались ампликоны IS481 и IS1002, но отсуствтовали ампликоны recA и IS1001. В случае B. parapertussis наблюдалась положительная реакция праймеров и зондов к IS1001 и IS1002, в случае B. holmesiiIS481 и recA.

Технология была применена в Бельгии для исследования 11919 случаев. В 1189 (10,0 %) образцах была найдена B. pertussis, из них 872 (73,3 %) удалось точно идентифицировать по предложенной схеме, остальные были отнесены к группе «B. pertussis под вопросом». 151 (1,3 %) образец содержал B. parapertussis, из них в 112 (74,2 %) были идентифицированы точно, остальные под вопросом. В 15 (0,1 %) образцах была найдена B. holmesii. Ещё в 425 образцах видовую принадлежность бордетелл идентифицировать не удалось. В 7 случаях была обнаружена коинфекция B. pertussis и B. parapertussis. Также в двух образцах была установлена коинфекция B. pertussis и B. holmesii.

Чувствительность метода составила 145 — 242 КОЕ на мл. Это гораздо выше культурального метода, поэтому только часть случаев удалось описать путём исследования выделенного в культуру патогена. Данные, полученные при генотипическом тестировании, были подтверждены при фенотипической идентификации. Из-за большой доли случаев неточного определения возбудителя метод лучше рассматривать в качестве скринингового и на основании его результатов принимать решения о последующих диагностических мероприятиях.

Исследование показало, что, несмотря на вакцинацию, B. pertussis выявляется в 10 раз чаще, чем B. parapertussis, которая, в свою очередь, в 10 раз более распространена, чем B. holmesii.

выявление возбудителя коклюша с помощью мультиплексной ПЦР

Martini H, Detemmerman L, Soetens O, Yusuf E, Piérard D. Improving specificity of Bordetella pertussis detection using a four target real-time PCR. PLoS One. 2017 Apr 12;12(4):e0175587.

Все новости

ФБУН НИИ эпидемиологии
и микробиологии имени Пастера
Отдел новых технологий