Набор для выявления антител класса G к антигенам Coxiella burnetii

Характеристика

Тест-система иммуноферментная для выявления антител класса G к антигенам Coxiella burnetii обеспечивает выявление в сыворотке крови человека антител класса IgG к антигенам Coxiella burnetii - возбудителю Ку-лихорадки.

Выявление антител осуществляется посредством их взаимодействия с сорбированными на полистироловых планшетах антигенами Coxiella burnetii. Визуализацию комплексов антиген-антитело производят с помощью конъюгата, представляющего собой поликлональные IgG(H+L)-антитела, меченные пероксидазой хрена.

Назначение

Тест-система иммуноферментная для выявления антител класса G к антигенам Coxiella burnetii предназначена для серологической текущей и ретроспективной диагностики Ку-лихорадки.

Состав набора

  • Комплект из 12 стрипов в рамке, сорбированных антигеном C. burnetii - 1 шт.
  • Положительная контрольная сыворотка (К+), содержащая антитела к C. burnetii, инактивированная прогреванием, по 1,5 мл, (малиновый раствор). Готова к применению без предварительного разведения - 1 пр.
  • Отрицательная контрольная сыворотка (К-), не содержащая антител к C. burnetii, инактивированная прогреванием, по 1,5 мл (жёлто-зелёный раствор). Готова к применению без предварительного разведения - 1 пр.
  • Концентрат конъюгата, меченного пероксидазой хрена (Концентрат конъюгата), по 0,25 мл (синий раствор) - 1 пр.
  • Концентрат фосфатно-солевого раствора, содержащий детергент (ФСРТ), по 20 мл (бесцветный раствор) - 1 фл.
  • Натрия хлорид, сухой (10 г) - 1 уп.
  • Цитратный буферный раствор с перекисью водорода (ЦБП), по 10,0 мл (бесцветный раствор) - 1 фл.
  • Раствор тетраметилбензидина (ТМБ), 2,5 мл (бесцветный раствор) - 1 фл.
  • Раствор для разведения конъюгата (РРК), 10,0 мл - 1 фл.
  • Раствор для разведения исследуемых проб (РИП) (синий раствор), 10,0 мл - 1 фл.
  • Раствор серной кислоты (Стоп-реагент), 5,0 мл (бесцветный раствор) - 1 фл.
  • Полиэтиленовый пакет с молнией - 1 шт.
  • Инструкция по применению - 1 шт.

Подготовка реагентов

Все растворы и реагенты необходимо выдержать перед началом работы при температуре (15 - 25) °С в течение 30 мин. Иммуноферментный анализ (ИФА) рекомендуется проводить с использованием новых, не подвергавшихся обработке наконечников для пипеток, работать в резиновых перчатках. Все использованные материалы подвергать обработке дезинфицирующими растворами (6 % раствором перекиси водорода или монохлорамина).

  • В зависимости от числа исследуемых проб отбирают необходимое количество стрипов (полосок по 8 лунок в каждой). Остальные стрипы вынимают из рамки-держателя и хранят в закрытом полиэтиленовом пакете с молнией.
  • Растворы каждого компонента тест-системы иммуноферментной для выявления антител класса G к антигенам Coxiella burnetii и каждого образца необходимо брать с помощью индивидуального наконечника для пипеток.
  • Раствор ФСРТ. Для получения рабочего раствора содержимое флакона с концентратом ФСРТ перенести в мерную колбу ёмкостью 500 мл и довести объём до метки дистиллированной водой. Перелить содержимое колбы в стакан, добавить содержимое пакета с хлоридом натрия и перемешивать до полного растворения последнего. Раствор хранить до 6 мес при температуре (4 - 6) °С.
  • Исследуемые сыворотки. Для получения необходимого (1:400) разведения следует произвести предварительное разведение, смешав 5 мкл исследуемой сыворотки с 95 мкл РИП (разведение - 1:20), используя дополнительный ряд микропробирок. В случае необходимости титрования сывороток разводить их раствором РИП с шагом 2. Разведённую сыворотку не хранить.
  • Раствор конъюгата. Концентрат конъюгата развести на растворе РРК 1:80. При этом раствор меняет свою окраску от синего до сиреневого цвета. Необходимый объём раствора конъюгата определяется числом используемых стрипов (например, при использовании 12 стрипов необходимо смешать 130 мкл концентрата конъюгата и 10,4 мл РРК). Хранить не более 4 час при температуре (4 - 6) °С.
  • Субстратный раствор. В зависимости от количества используемых стрипов готовят необходимый объем субстратного раствора путем смешивания соответствующих объемов реагента ТМБ и ЦБП перед проведением ферментативной реакции. Полученный субстратный раствор должен оставаться бесцветным или слегка голубоватым. Необходимый объём раствора субстрата определяется числом используемых стрипов (см. таблицу). Хранению не подлежит.
    Таблица расхода компонентов тест-системы иммуноферментной для выявления антител класса G к антигенам Coxiella burnetii (указан с избытком)

Проведение иммуноферментного анализа

Для исключения ложноположительных результатов исследуемые сыворотки необходимо готовить и хранить в стерильных условиях, исключающих возможность бактериального пророста. Необходимо осветлять образцы сывороток, содержащих осадок и агрегаты, путём центрифугирования. Не использовать сыворотки с выраженным гемолизом, гиперлипидемией и бактериемией. Для выявления антител к антигенам коксиелл Бернета возможно использование сыворотки крови людей как свежей, так и хранившейся при 2 - 10 °С не более 48 часов после забора крови, либо замороженной и хранившейся (исключить промежуточное оттаивание) при минус 20 °С не более 6 месяцев. Для приготовления реагентов и проведения ИФА следует использовать чистую мерную посуду и автоматические пипетки с погрешностью измерения объёмов не более 5 %. Для каждого реагента и пробы использовать отдельные чистые наконечники для пипеток.

  • Гидратация сорбированного Ку-антигеном планшета. Во все лунки стрипов внести по 200 - 300 мкл раствора ФСРТ. Инкубировать в течение 1 - 2 мин при температуре 15 - 25 °С. Удалить содержимое лунок в ёмкость с дезинфицирующим раствором, тщательно удалить остатки содержимого лунок лёгкими постукиваниями перевёрнутой рамки по стопке фильтровальной бумаги.
  • Связывание Ку-антител. Одну из лунок (А1) оставить незаполненной в качестве контроля субстрата, в лунки В1 и С1 внести по 100 мкл красного раствора К+, в D1 - 100 мкл зеленого раствора К-. В лунки E1, F1, G1 и H1 внести по 95 мкл раствора ФСРТ и по 5 мкл предварительно в 20 раз разведённых в РИПе исследуемых сывороток в дубле. Таким образом, исследуемая сыворотка в лунке разбавляется, в конечном счёте, в 400 раз. Для получения корректных результатов рекомендуется исследовать сыворотки в дубле и для каждой делать два независимых разведения.
    Планшет закрыть крышкой или поместить во влажный полиэтиленовый пакет и инкубировать в течение 1 часа при температуре (37 ± 1) °С.
    После инкубации лунки промыть трехкратно раствором ФСРТ аналогично п. 1.
  • Связывание конъюгата. Во все лунки кроме А1 внести по 100 мкл рабочего раствора конъюгата сиреневого цвета. Планшет закрыть крышкой или поместить во влажный полиэтиленовый пакет и инкубировать при температуре (37 ± 1) °С в течение 1 часа во влажной камере.
    После инкубации лунки промыть пятикратно раствором ФСРТ аналогично п. 1.
  • Проведение ферментативной реакции. Во все лунки внести по 100 мкл субстратного раствора, приготовленного непосредственно перед проведением реакции. Планшет закрыть крышкой и выдержать в темноте при температуре (15 - 25) °С в течение (20 ± 1) мин.
  • Остановка ферментативной реакции. Реакцию необходимо остановить внесением в каждую лунку по 50 мкл раствора серной кислоты и перемешать. Измерить оптическую плотность при длине волны 450 нм, используя фотометр. Выведение фотометра на нулевой уровень ("бланк") осуществлять по лунке А1. Окраска в лунках стабильна в течение 20 мин.

Контроль качества и регистрация результатов

При правильном проведении всех стадий анализа содержимое лунок с контролем субстрата и К- должно оставаться бесцветным или бледно-желтым, а содержимое лунок с К+ должно приобрести желто-коричневую окраску.

Результаты эксперимента регистрируются, если:
- значение ОП контрольной отрицательной сыворотки - ОПсрК- ≤ 0,2;
- среднее значение контрольной положительной сыворотки ОПсрК+ ≥ 0,80.

Интерпретацию результатов для каждой анализируемой сыворотки следует проводить, используя таблицу.
Таблица интерпретации результатов ИФА

Положительный результат ИФА, то есть выявление антител к C. burnetii, может свидетельствовать как о текущем заболевании Ку-лихорадкой, так и об инфицированности (или иммунизации) C. burnetii в прошлом.

Для постановки окончательного диагноза Ку-лихорадки необходим комплекс серологических, клинических и эпидемиологических данных.

Форма выпуска

Тест-систему иммуноферментную для выявления антител класса G к антигенам Coxiella burnetii выпускают в виде комплекта, упакованного в коробку. Один комплект рассчитан на проведение от 1 до 96 анализов, включая контроли.

Условия хранения и транспортировки

  • Хранение и транспортирование проводят в соответствии с СП 3.3.2.028-95 при температуре (2 - 8) °С. Замораживание не допускается. Транспортировку осуществлять всеми видами крытого транспорта при температуре (2 - 8) °С не более 2 недель.
  • Срок годности тест-системы иммуноферментной для выявления антител класса G к антигенам Coxiella burnetii - 6 месяцев со дня выпуска.
  • При нарушении условий хранения, транспортировки и схемы постановки ИФА рекламации не принимаются.

Главная ::  Каталог "Иммуноферментные тест-системы" ::  Список инструкций

ФБУН НИИ эпидемиологии
и микробиологии имени Пастера
Отдел новых технологий